高雄區農業改良場研究彙報 第 6 卷第 2 期 84 年 6 月出刊
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毛豆花葯培養癒合組織之切片觀察及繼代培養1

韓青梅 陳庚鳳 洪啟善2

摘 要

毛豆之花葯具有四個花粉囊，花粉囊相連處具有結締組織。毛豆花葯所產生
之癒合組織經切片觀察結果得知，花葯培養形成之癒合組織除由花粉細胞增殖產
生外，其他細胞如花葯壁或結締組織細胞均可增殖。因此癒合組織由何種細胞增
殖而來目前從外表無法判定其來源，但由切片觀察獲知早期形成之癒合組織大多
來自於體細胞，而花粉細胞形成之癒合組織出現較晚。如欲確定癒合組織之來源
，尚待未來誘導成植株後以檢查根尖染色體判定之。癒合組織之繼代培養以MS基
本培養基搭配5mg/L Kinetin 、0.05mg/L IAA、CW 150ml最適宜。

關鍵詞：毛豆、花葯癒合組織、繼代培養、石蠟切片。
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1.本試驗承行政院農業委員會經費補助，謹致謝忱。
2.台灣省高雄區農業改良場助理研究員、副研究員及約僱員。

前 言

利用花葯組織培養誘發單元體植物是為最直接之方法(陳、張,1974)， 經染
色體加倍後可成為一固定之品系，直接提供育種選拔之材料，在育種方面具有實
用性與發展潛力(蔡,1986) 。然因分化成植株之比率不高(陳、張,1974) 在實用
上尚有很大差距，若能解決此一難題，達成量產之目標，必可直接提供品種改良
之用。 毛豆實為大豆， 過去有關花葯組織培養之研究報告不多， 據尹光初等
(1982)報告採用變動的B5培養基， 成本五P大豆花葯單元體植株。 Ivers等
(1974)以Nitschs或Miller培養基， 只誘起芽體並未形成單元體植株，因此大豆
花葯培養目前並無穩定之技術可資遵循。本場於民國八十一年開始進行毛豆栽培
品種高雄2號及高雄3號之花葯培養，目前已經建立癒合組織形成之體制，為了瞭
解癒合組織源自於何種細胞，又如何維持癒合組織之活力以利再生，故而進行癒
合組織之石蠟切片觀察及繼代培養最適培養基與培養時期之研究。

材料與方法

一、供試材料：培養高雄二號及高雄三號花葯產生之癒合組織。
二、實施方法：
(1) 石蠟切片觀察：將材料利用石蠟切片法製成永久片觀察其發育情形，石蠟切
片法之步驟如下：
1.樣品→FAA固定4小時(配合抽氣1小時)。
2.50％乙醇洗3次。
3.TBA－系列脫水。
4.滲蠟：60～65℃烘箱內操作，將小蠟塊以 3～5次加入，最後一次加入蠟塊
經2小時後打開瓶說A令瓶內第三級丁醇全部蒸發。
5.埋蠟：將瓶內之材料和液狀蠟倒入模型內，置於冷水中快速冷卻凝固成蠟塊。
6.切片：切片厚度10μ。
7.展片：蠟帶放於載玻片上展開於46℃之hot plate 上乾燥1～3天。
8.染色和脫水：經一系列之染色和脫水。
9.滴巴爾森液覆上賑薑龤C
(2) 癒合組織之繼代培養：毛豆花葯培養產生之癒合組織，繼代培養於MS、N6、
B5等不同培養基，並搭配2,4-D、Kinetin、IAA等植物生長調節劑，觀察其生
育情形。

結果與討論

一、石蠟切片觀察：
毛豆之花葯經石蠟切片觀察得知有四個花葯囊，花葯囊相連處有維管束組織
，稱之為結締組織(connective tissue)，花葯壁由兩層細胞組成， 花葯囊內之
花粉大而圓，充滿活力(圖1-A）。培養一星期之花葯，其花粉細胞仍然大而圓有
活力(圖1-B）， 培養3星期白化死亡之花葯，經石蠟切片觀察結果得知，花葯壁
細胞稍有增殖後就不再增生，花葯囊內之花粉細胞大多變形為多角形，已失去活
力，故白化而死亡(圖1-C)。培養3星期之花葯，未白化死亡者已長出癒合組織，
經石蠟切片觀察之結果發現癒合組織均由結締組織細胞之增殖產生，花葯囊因受
擠壓變成一小空間，內部花粉細胞因無法分裂，且得不到養分，以致變形而失去
活力，此所生成之癒合組織大部分來自體細胞(圖1-D）。 培養4星期之花葯，經
石蠟切片觀察結果發現，由花葯壁之細胞及結締組織細胞共同發育成癒合組織，
花葯囊受擠壓變小，囊內之花粉細胞變形死亡而無法分裂(圖2-A)。 亦有由花葯
囊之細胞壁細胞增殖，而花葯囊受擠壓變形，內部之花粉細胞無養分供應變形死
亡(圖2-B)，此等癒合組織均屬於體細胞形成，圖2-C左邊花葯囊內之花粉細胞分
裂突破花葯壁後長出癒合組織，而右邊之花葯囊內之花粉粒則未發育形成空腔。
培養5星期之花葯， 經石蠟切片觀察結果發現，花葯囊內之花粉細胞正常分裂而
形成之癒合組織已經突破花葯囊壁生長(圖2-D)。 由以上之切片觀察結果得知，
花葯培養所誘導之癒合組織有些是由花葯壁與結締組織細胞形成，有些為花粉細
胞增殖形成，而此種癒合組織正是我們所希望者，但花葯內各種細胞均有機會增
殖為癒合組織，無法由外表判定其來源為花粉細胞或花葯體細胞。故需待未來誘
導成植株後以檢查根尖染色體判定之。但由以上之形態切片觀察可獲知早期出現
之癒合組織，大多數為體細胞形成，而花粉細胞形成之癒合組織一般出現較晚，
此與尹氏等(1982)之試驗報告相同。

二、癒合組織之繼代培養：
毛豆花葯培養產生之癒合組織生長約4星期後， 必須行繼代培養以維持活力
，否則即會產生褐化、萎縮之現象，究竟以何種培養基為繼代培養最適宜之培養
基，本場進行了一系列之試驗。 其結果由表1得知，在相同之MS基本鹽類分別添
加1、5、10、15 mg/L四種濃度之2,4-D，培養2-3星期後，全部褐變而死亡。 因
此得知植物生長調節劑2,4-D，其濃度無論高低(1～15mg/L)對毛豆花葯培養誘導
產生之癒合組織，行繼代培養時均不適宜。 雖然2,4-D在釵h植物之花葯培養，
尤其是水稻，為誘發癒合組織最重要之植物生長調節劑(陳1980，蔡1986)，但對
毛豆花葯癒合組織之繼代培養表現較差。接著又以N6、B5及MS三種培養基分別加
入5 mg/L Kinetin、0.05mg/L IAA及150ml/L椰子水(CW)， 進行毛豆癒合組織繼
代培養。 由表2結果得知，在N6培養基下，全部褐變而死亡，在B5培養基下呈現
黃色，組織鬆軟，雖可存活但不會增殖。在MS培養基下，不但癒合組織呈現鮮綠
色、組織緊密、活力旺盛且會增殖。因此毛豆花葯癒合組織之繼代培養以MS培養
基搭配Kinetin 5 mg/L、IAA 0.05mg/L及椰子水(CW)150ml/L，且以每4星期培養
一次為最適宜。

表1. MS基本鹽類搭配不同濃度之2,4-D對毛豆花葯癒合組織繼
代培養之影響
Table 1. Effect of medium on the subculture of anther
callus of vegetable soybean.
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植物生長調節劑 癒合組織生育情形
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基本鹽類 2.4-D KN IAA 高 雄 高 雄
(mg/L) (mg/L) (mg/L) 2 號 3 號
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MS 1 0 0 褐化死亡 褐化死亡

MS 5 0 0 " "

MS 10 0 0 " "

MS 15 0 0 " "
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表2 不同之培養基搭配相同之植物生長調節劑對毛豆花葯癒合組
織繼代培養之影響
Table 2. Effect of media on the subculture of anther
callus of vegetable soybean.
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植物生長調節劑 癒合組織生育情形
──────── ──────────
基本鹽類 KN IAA C.W 高 雄 高 雄
(mg/L) (mg/L) (ml/L) 2 號 3 號
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N6 5 0.05 150 褐化死亡 褐化死亡

B5 5 0.05 150 黃色，組織 黃色，組織
鬆軟，雖能 鬆軟，雖能
存活不增殖 存活不增殖
PT* 5 0.05 150 鮮綠色，組 鮮綠色，組
織緊密，會 織緊密，會
增殖 增殖
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* PT: 基本鹽類為MS配方。

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A: 未培養前之花葯切片 B: 培養一週之花葯切片
An anther before culture (100 X) Anther after 1 week in culture (200 X)

con: 結締組織 (connective tissue) con: 結締組織 (connective tissue)
aw : 花葯壁細胞 (anther wall) aw : 花葯壁細胞 (anther wall)
p : 花粉 (pollen) p : 花粉 (pollen)
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C: 培養三週白化死亡之花葯切片 D: 培養三週之切片
White and dead anther after Anther after 3 weeks in culture (100 X)
3 weeks in culture (200 X) cc : 結締組織長出之癒合組織
con: 結締組織 (connective tissue) (callus of connective tissue)
aw : 花葯壁細胞 (anther wall) aw : 花葯壁細胞 (anther wall)
p : 花粉 (pollen) p : 花粉 (pollen)
ac :花粉囊 (anther sac)

圖1.毛豆花葯培養三週內各時期之解剖觀察
Fig.1 Anatomy observation on the third week in anther culture
of vegetable soybean by paraffin section method.

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圖2.毛豆花葯培養第四、五週之解剖觀察
Fig.2 Anatomy observation on anther culture of vegetable
soybean during growth forth and fifth week by paraffin
section method.
A: 培養四週之切片，花葯壁及結締組織長出癒合組織之情形
Callus formed from anther wall and connective tissue
after 4 weeks in culture. (400 X)
cc : 結締組織長出之癒合組織 (callus of connective tissue)
awc: 花葯壁癒合組織 (anther wall callus)
p : 花粉 (pollen)
B: 培養四週之切片，花葯壁細胞長出癒合組織之情形
Callus formed from anther wall after 4 weeks in culture.
(400 X)
awc: 花葯壁癒合組織 (anther wall callus)
p : 花粉 (pollen)
C: 培養四週之切片，左邊花葯囊內花粉細胞長出癒合組織，右邊
則未發育之情形
Callus formed from pollen cell of left anther sac，but
right’s undivided after 4 weeks in culture.(100X)
aw :花葯壁細胞 (anther wall)
pc :花粉癒合組織 (pollen callus)
con:結締組織 (connective tissue)
D: 培養五週之切片，花葯囊內花粉細胞長出癒合組織之情形
Callus formed from pollen cell after 5 weeks in
culture.(200 X)
aw :花葯壁細胞 (anther wall)
pc :花粉癒合組織 (pollen callus)
con:結締組織 (connective tissue)
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圖3.不同培養基對毛豆花葯癒合組織繼代培養之影響
Fig.3 Effect of media on the subculture of anther
callus of vegetable soybean.

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圖4.毛豆花葯癒合組織繼代培養於 PT 培養基之情形
Fig.4 A anther callus of vegetable soybean
subculture in PT medium.

參考文獻

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